下面是小编为大家整理的微生物复筛【精选推荐】,供大家参考。
西藏农牧学院高原生态研究所 来源：
中国************
作者：
张 新 军 本文来源: 医药社区
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s6 G5 Y! p [摘
要]：
本文研究了从土壤中筛选淀粉酶产生菌， 并对产生淀粉酶的发酵条件进行了探讨。从不同的地点所采的 5 个土样中共分离到 52 株淀粉酶生产菌， 其菌落水解圈直径从 0. 5mm到 27mm, 其中活性较强的有 6 株， 都超过 20mm， 其中 NMXY－3 号菌株活性最强， 对其初步鉴定为双球菌属， 命名为 diplococcus sp.
NMXY－3。
以 NMXY－3 号菌株为对象研究了发酵条件对该菌产生淀粉酶的影响， 其中， 在淀粉、 麦芽糖、 乳糖、、 蔗糖 5 种常用碳源中，淀粉是发酵产生淀粉酶的最佳碳源； 常用有机氮源牛肉膏、 蛋白胨、 酵母膏中， 酵母膏对产生淀粉酶最有利； 在金属离子 Na+、 K+、 Ca2+、 Mg2+、 Zn2+中， Ca2+对产生淀粉酶的促进作用最明显； 而当培养温度在 30℃左右时， 该菌株产生的淀粉酶的量最大； NMXY－3 号菌株产生的淀粉酶培养基的最佳 pH 值是 pH7. 0 左右。本文来源: 医 药社区 http: //www. pharmst . cn
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[关键词]：
淀粉酶； 菌种筛选； 土壤微生物； 水解圈； 发酵条件 本文来源: 医药社区 http: //www. pharmst. c n,
c4 D6 [% h3 T6 i! A( E+ B- c The Isolation of Amylase-producing Bacterial Strains from Soil and Studies on the Amylase-producing Fermentation Conditions
Abstract 52 α -amylase producing strains are screened using plate hydrolysis spot method form soil,
their plate hydrolysis spot diameters covered from 0. 5 mm to 27 mm.
The plate hydrolysis spot diameter of NMXY－3 strain is 27 mm,
and the strain was identified as diplococcus sp.
The strain NMXY－3 was named diplococcus sp.
NMXY－3.
The primary optimization of cultivation conditions was selected through fermentation tests.
The appropriate carbon source is starch,
the appropriate nitrogen source is yeast extract and the appropriate metal ion is Ca2+.
The optimal initial pH is 8. 0,
the optimal incubation temperature is 30℃.本文来源: 医药社区 ht tp: //www. pharmst. cn8 ?1 j+ f( A% c5 ^* [2 N5 O% }
Key words：
amylase
screening
soil microbe
plate hydrolysis spot
fermentation condition
天然淀粉中直链的约占 22％～26％， 它是可溶性的， 其余的则为支链淀粉。
当用碘溶液进行检测时， 直链淀粉液呈显蓝色， 而支链淀粉与碘接触时则变为红棕色［1， 2， 3］ 。淀粉作为可再生的工农业原料， 在工农业产生中有着广泛的应用。本文来源: 医药社区 http: //www. pharms t. cn( ?4 i+ R.
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淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称， 主要包括 α －淀粉酶和 β -淀粉酶等， 淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中， 淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依据， 也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应的依据。
淀粉酶是最早用于工业生产并且抉仍是用途最广、 产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多， 特点各异， 可应用于造纸、 印染、 酿造、 果汁和食品加工。
医药、 洗涤剂、 工业副产品及废料的处理、 青贮饲料及微生态制剂等多种领［3， 4］ 。
由于微生物数量多， 繁殖快， 工业生产主要采用微生物发酵法大量生产该制剂［3－8］ 。
关于淀粉酶活力的测定方法有多种， 其中最常用的是以下三种：
（1）
平板水解圈法，此方法是根据淀粉遇碘呈现蓝色， 随着淀粉水解为糊精， 蓝色逐渐消失面成为棕色反应物。
（2）
硝基水杨酸法反应比色法 淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与 3, 5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。
（3）
碘反应比色法， 根据淀粉酶作用后淀粉溶液与碘反应时蓝色物消失， 通过比色测定光吸收值， 就可衡量该酶活力的大小［9， 10］ 。
土壤是微生物存在的最佳场所， 土壤中的微生物种类和数量都是惊人的， 从土壤筛选淀粉酶高产菌株是一个有效途径［1］ 。
本研究是从土壤中筛选可产生高活性淀粉酶细菌为目的。
在产生淀粉酶的微生物中， 关于产生淀粉酶的真菌的研究较多， 应用也较为广泛， 其中生产上用到最多的是真菌中的根霉和曲霉。
由于细菌的研究较少， 且细菌的不仅培养更为容易， 而且其代谢活力更强［1］ ，因此， 本研究拟从土壤中筛选可产生高活力淀粉酶的细菌菌株， 以期获得更经济、 易得的高活力淀粉酶。
1、 材料与方法 本文来源: 医药社区 http: //www. pharmst. cn4 O! V0
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1. 1、 土样来源
采自西藏高原生态所， 共 5 个土样。
1. 2、 培养基和试剂 本文来源: 医 药社区 http: //www. pharmst . cn$ r1 N! } & | # B( m"
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（1）
分离培养基 采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加 0. 2%可溶性淀粉， 即牛肉膏 3g、 蛋白胨 10g、 NaCl 5g、 可溶性淀粉 2g 溶于 1000mL 蒸馏水中， 再加入 15g 琼脂粉， pH 调至 7. 2，121℃灭菌 15min， 待冷却至 50℃左右时， 于超净工作台倒平板。
（2）
分离培养基液体培养基 采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加 0. 2%可溶性淀粉， 即牛肉膏 3g、 蛋白胨 10g、 NaCl 5g、 可溶性淀粉 2g 溶于 1000mL 蒸馏水中，
pH 调至 7. 2， 121℃灭菌 15min。
（3）
检测培养基 2g 淀粉溶于 1000mL 蒸馏水中， 再加入 15g 琼脂粉， pH 调至 7. 2， 121℃灭菌 15min， 待冷却至 50℃左右时， 于超净工作台倒平板。
（4）
发酵培养基 初始 pH 培养基 在分离培养基基础上 （不加琼脂粉）
配制 pH 为 5. 0，6. 0， 7. 0， 8. 0， 9. 0 共 5 种液体培养基。
（5）
碳源培养基 共 5 种不同的碳源， 它们的基础溶液为：
牛肉膏 3g、 蛋白胨 10g、NaCl 5g、 蒸馏水 1000mL； 在此基础上， 分别加入 2g（1）
淀粉、 （2）
麦芽糖、 （3）
乳糖、（4）、 （5）
蔗糖， pH 调至 7. 2， 121℃灭菌 15min。
（6）
氮源培养基 共 5 种不同的氮源， 它们的基础溶液为：
淀粉 2g、 NaCl 5g、 蒸馏水 1000mL； 在此基础上， 分别加入（1）
牛肉膏 13g、 （2）
蛋白胨 13g、 （3）
酵母膏 13g、（4）
牛肉膏 3g、 蛋白胨 10g， pH 调至 7. 2， 121℃灭菌 15min。
（7）
金属离子培养基 共 5 种不同的金属离子， 它们的基础溶液为：
牛肉膏 3g、 蛋白胨 10g、 、 蒸馏水 1000mL； 在此基础上， 分别加入 5g（1）
NaCl、 （2）
KCl、 （3）
CaCl2、（4）
MgSO4、 （5）
ZnSO4， pH 调至 7. 2， 121℃灭菌 15min。
（8）
检测试剂（路戈氏碘液）
碘片 1g， 碘化钾 2g， 蒸馏水 300mL。
配制方法：
先用少量（3－5mL）
蒸馏水溶解碘化钾， 再加入碘片， 待碘片完全溶解后， 加水稀释至 300mL，于棕色瓶内备用［12］ 。
1. 3、 淀粉酶活力的测定 本文来源: 医 药社区 http: //www. pharms t. cn,
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在淀粉酶产生菌的初筛实验中， 以菌落周围形成水解圈直径的大小作为淀粉酶活力的初步判定的依据， 水解圈大的， 淀粉酶的活力就大［5］ 。
在测定发酵液中淀粉酶的活性时， 采用检测检测培养基打孔法进行测定， 其实质是检测的单位体积发酵液上清液的淀粉酶的活性。
将发酵液 8000rpm 离心 5min， 取上清液。
在检测培养基上面打孔后， 将上清液加入到孔中后放入恒温箱中静置 8h 后取出, 把路戈氏碘液加本文来源: 医药社区
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入到平板中， 涂布均匀， 量取水解圈的直径并进行数据分析。
此方法的注意以下操作：
在倒平板时， 应使同一平板和不同平板培养基的厚度一致， 培养基的表面要平。
加入的上清液的量要一致。
否则就会影响实验结果。
其原理是根据淀粉酶的活性与其形成的水解圈的直径之间虽然不完全成正比， 但成正相关， 水解圈的直径越大， 其活性就越高。
1. 4、 微生物的分离
用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌。
取所采 5 个土样各 5g， 分别加入到三角瓶中， 加入无菌水 45mL， 30℃摇床振荡 30min 制成土壤悬液， 此时的稀释度为 10-1。
另取 30 支试管，分为 5 组， 每组 6 支， 分别记作 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7、 10-8 共 8 个梯度，每支试管内加入 9mL 无菌水。
用无菌移液管从三角瓶中吸取 1mL 土壤悬液， 加入到 10-2 试管中混匀， 再从此试管中吸取 1mL 加入到 10-2 试管中， 依此类推直至 10-7 试管。
分别从10-6、 10-7、 10-8 三个稀释度的试管中吸取 100uL 悬液， 均匀涂布于分离培养基平板上，于 30℃培养 36h， 等长出菌落后， 根据菌落不同挑取菌落进行保存并编号。
同时， 将检测试剂（路戈氏碘液）
加入到平板中， 涂布均匀， 菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株， 记住其编号， 以便进行下一步的复筛。
1. 5、 淀粉酶高产菌株的复筛
在初筛中分离到的产淀粉酶的菌株活化后接入装有分离培养基液体培养基的三角瓶中，对其于 30℃摇床进行发酵培养 48h， 对发酵液 8000rpm 离心 5min， 取上清液。
在检测培养基上面打孔后， 将上清液加入到孔中后放入恒温箱中静置 8h 后取出, 把路戈氏碘液加入到平板中， 涂布均匀， 水解圈大的其发酵液上清中的淀粉酶的活性就高， 取活性最高的菌株作为目的菌株， 对其进行发酵条件实验。
1. 6、 发酵条件的优化 本文来源: 医 药社区 http: //www. pharmst . cn- | ,
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在所得的具有淀粉酶活性的菌株中， 取淀粉酶活性最强的菌株作为研究对象， 对其最佳的发酵条件进行研究。
在发酵条件中， 我们选取了培养基的初始 pH 值、 培养温度梯度、 碳源、 氮源、 金属离子等指标进行发酵实验。
7 种培养基的初始 pH 值、 5 种碳源、 3 种氮源、 5 种金属离子等用相应的培养基， 培养温度梯度实验用分离培养基液体培养基在不同的温度 4 种温度下培养。每个指标做 3 个重复， 取平均值。
培养 2d 后， 取发酵液， 8000rpm 离心 5min， 取上清液。在检测培养基上面打孔后， 将上清液加入到孔中后放入恒温箱中静置 8h 后取出, 把路戈氏碘液加入到平板中， 涂布均匀， 量取水解圈的直径并进行数据分析。
2、 结果与分析
2. 1、 菌株的分离与筛选 本文来源: 医 药社区 http: //www. pharms t. cn& h8 H0 Y6 b& @/ \( o
通过梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌共得到 52 株淀粉酶生产菌， 其水解圈直径从 0. 5mm到 27mm, 其中活性较强的细菌有 6 株。
将这 6 株菌进行复筛， 用分离培养基液体培养基发酵培养 2d 离心后， 用检测培养基打孔检测其上清液， 8h 后测得水解圈直径分别为：
24mm、 27mm、21mm、 23mm、 20mm、 21mm。
其中水解圈直径为 27mm 的菌株为 NMXY－3， 因此选取 NMXY－3号菌株作为目的菌株， 如图 1 所示：
（略）
图 1 目的菌株在分离平板上形成水解圈
2. 2 NMXY－3 号菌株的初步鉴定
对此菌株于牛肉膏蛋白胨培养基培养 18h 后， 挑取少量菌体作涂片后用结晶紫染色后，用光学显微镜油镜观察， 其菌体呈球状， 及其生理特征初步判定其为一种双球菌， 命名为diplococcus sp.
NMXY－3， 如图 2 所示：
（略）
图 2 目的菌株在油镜下的形态（1000 倍）
在产生淀粉酶的细菌中， 研究较多的有枯草杆菌、 地衣芽孢杆菌等杆菌类， 而该淀粉酶产生菌为双球菌， 具有一定的新意。本文来源: 医药社区 http: //www. pharms t. cn,
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2. 3、 淀粉酶发酵条件的优化 本文来源: 医药社区 http: //www. pharms t. cn:
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发酵条件对微生物产生代谢产物有着重要影响， 在特定的发酵条件下， 微生物的某些代谢产物就为最主要的代谢产物。
淀粉酶作为微生物的重要代谢产物， 也同样受其培养条件的影响， 下面是分别对 NMXY－3 号菌株的培养基的初始 pH 值、 培养温度梯度、 碳源、 氮源、金属离子等指标进行发酵实验， 获取最佳培养条件， 以便更大限度地获得优良的淀粉酶。本文来源: 医药社区 http: //www. pharmst. cn)
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2. 3. 1、 培养基的初始 pH 值 本文来源: 医药社区 http: //www. pharmst. cn)
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对微生物的培养过程中， 发酵液往往会随着培养时间的延长， 其 pH 也会发生变化的，而培养基的初始 pH 值对微生物产生特定的代谢物也有很大影响， 通过对培养基的初始 pH值处于 6. 0， 6. 5， 7. 0， 7. 5， 8. 0， 8. 5， 9. 0 共 7 个不同的梯度时产生淀粉酶的情况， 来获取其最佳的初始 pH 值。
这 7 种发酵液的上清在检测培养基上形成的水解圈的直径如表 1 和图 3 所示：
（略）图 3 培养基初始 pH 对酶活力的影响 本文来源: 医药社区 http: /...